print close

Диагностика и интегрированное обследование больных
с острым лимфобластным лейкозом

Diagnostic and integrated work-up for the management of Acute Lymphoblastic Leukemia

Robin Foa and Antonella Vitale
Division of Hematology, University "La Sapienza", Rome, Italy (March 2007)
European Leukemia Net

Диагностика и интегрированное обследование больных с острым лимфобластным лейкозом

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) представляет собой биологически и клинически гетерогенную группу заболеваний, характеризующихся клональной пролиферацией незрелых гемопоэтических клеток. Диагностика и классификация ОЛЛ представляет собой многоступенчатый процесс, базирующийся на следующих исследованиях:

и является результатом одновременного применения нескольких видов исследования.

Морфология

Диагноз ОЛ устаноавливается при обнаружении более 30% лимфоидых бластных клеток в костном мозге или периферической крови (по классификации Франко-Американско-Британской Кооперативной группы ФАБ) или более 20% – по классификации, предложенной Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ).

В отличие от острого миелоидного лейкоза, для ОЛЛ не существует единственного диагностически специфического цитохимического теста; тем не менее, по определению, бластные клетки при ОЛЛ должны быть негативны при окраске на миелопероксидазу и не окрашиваться анти-МПО антителами. Морфологическое и цитохимическое исследование выделяет 3 морфологических типа ОЛЛ: L1, L2, L3, однако, только L3 тип ОЛЛ имеет определенные уникальные морфологические, иммунофенотипические и генотипические черты.

Имунофенотип

Иммунофенотипирование является обязательным компонентом первичной диагностики ОЛЛ и, кроме того, методом, позволяющим контролировать минимальную остаточную болезнь (МОБ) во время лечения и по его окончании. Иммунофенотипическая характеристика бластных клеток имеет несколько целей:

Необходимым и достаточным для диагностики является следующий ряд антител: cyMPO, D117, TdT, cyCD3, CD7, cyCD79a, CD19

Для более точного установления диагноза рекомендуется двухступенчатое исследование:

В-клеточный ОЛЛ (70-80% случаев) классифицируется в 4 группы, соответственно экспрессии В-клеточных дифференцировочных антигенов, а также цитоплазматических и поверхностных иммуноглобулинов. Т-клеточный ОЛЛ (15-25% случаев) тоже классифицируется на 4 группы согласно экспрессии дифференцировочных антигенов. Т-ОЛЛ может быть также классифицирован по подтипу определяемого Т-клеточного рецептора.

Другие маркеры используются для оценки зрелости бластных клеток и выявления атипичного или аберрантного фенотипа. Довольно большой процент ОЛЛ экспрессирует нелинейные маркеры, например миелоидные или CD34. Частота ОЛЛ с экспрессией миелоидных маркеров варьирует от 15 до 40%, наиболее часто выявляются CD33 (около 25%) и CD13 (примерно 20%); CD15 и в CD14 определяются примерно в 15% случаев, в то время, как CD11с редко встречается при ОЛЛ. Миелоидные антигены могут использоваться как маркеры для иммунофенотипического мониторинга МОБ. CD34 является наиболее частым маркером, используемым для выявления незрелых гемопоэтических клеток, и около 70% случаев ОЛЛ позитивны по этому антигену. CD34 чаще экспрессируется при В-ОЛЛ (70-80%), чем при Т-ОЛЛ (20-30%), его экспрессия выявляется в большинстве случаев ОЛЛ с Ph-хромосомой.

Определение уровня экспрессии в лейкемической популяции может иметь терапевтическое применение. Так, например, это относится к антигенам CD20, CD22, CD52, для которых разработаны препараты, содержащие специфические антитела. Позитивность по этим антигенам и степень их экспрессии важны для планирования использования антител в терапии ОЛЛ.

Цитогенетический и молекулярный анализ

Цитогенетическое исследование является базисным для выявления молекулярных событий, участвующих в канцерогенезе при ОЛЛ, таких, как образование химерных транскриптов при транслокациях, потеря генов-супрессоров опухоли или генов-регуляторов клеточного цикла при делециях. Частота хромосомных аномалий при ОЛЛ может быть установлена лишь приблизительно, Это связано как с различиями в используемых методиках, так и со значительным процентом неудачных исследований. Зачастую бластные клетки при ОЛЛ плохо делятся в культуре и из-за малого количества метафаз важные хромосомные перестройки могут не быть обнаружены. Хромосомные аберрации при ОЛЛ могут быть числовые, структурные, а также сочетаться – и те, и другие.

В настоящее время разработаны новые методы молекулярной цитогенетики, позволяющие выявлять генетические нарушения, не обнаруживаемые при стандартном исследовании:

Хромосомные аномалии представляют собой очень значимый независимый фактор прогноза при ОЛЛ. Большинство наиболее часто встречающихся структурных реарранжировок изучены на молекулярном уровне. Хромосомные аномалии или их субмикроскопические эквиваленты можно, в целом, разделить на две группы: качественные, когда поломка возникает в гене-мишени и приводит к образованию химерного протеина и количественная, к которым относятся нарушения реарранжировки Ig или TCR. Результатом качественных нарушений является функционирующий химерный ген, самым ярким примером образования которого является транслокация t(9;22)(q34,q11), ведущая к формированию гена BCR-ABL. К количественным аномалиям относятся происходящие при перемещении протоонкогена под регуляторные последовательности реарранжированного Ig или TCR, что приводит к бесконтрольной экспрессии протеина. Примером такой перестройки может служить SIL-TAL1/TAL1 делеции на хромосоме 1q32 при Т-ОЛЛ.

Детекция клональных генетических маркеров при лейкозах на молекулярном уровне является предметом молекулярно-биологических исследований. В большинстве случаев используется обратно-транскриптазная полимеразно-цепная реакция (ОТ-ПЦР). Исследуется два типа характерных последовательностей: участки, близкие к точке разрыва в химерных онкогенах (при транслокациях, делециях, инверсиях) или регионы клонально перестроенных Ig или TCR. В настоящее время для детекции все чаще стала использоваться ПЦР в реальном времени.

Основные генетические аномалии, исследуемые при В-ОЛЛ:

Основные генетические аномалии, исследуемые при Т-ОЛЛ:

Минимальная остаточная болезнь

Лейкемические клетки могут быть отличены от нормальных с помощью морфологического и цитохимического исследования, а также с помощью иммунофенотипирования, исследования генетических аномалий, перестройки Ig/TCR. Все эти методы используются для возможного определения малых количеств бластных клеток у больных в ремиссии – минимальной остаточной болезни (МОБ). Классическими критериями ремиссии у пациентов с острым лейкозом базируются на морфологическом исследовании костного мозга. Считается, что в костном мозге больного в ремиссии должно выявляться не более 5% бластных клеток. Однако во время морфологической ремиссии уровень МОБ может значительно варьировать.

Методы исследования МОБ включают:

Возможность использования методики для исследования МОБ основана на следующих параметрах:

Только у части больных с ОЛЛ обнаруживается специфический молекулярный маркер, такой как хромосомные транслокации, например, t(9;22), t(4;11), t(1;19). Стандартный цитогенетический анализ может использоваться для мониторирования МОБ при наличии аномалий кариотипа при первичной диагностике. Однако этот метод обладает достаточно низкой чувствительностью, учитывая частое отсутствие метафаз. Основным преимуществом метода FISH является возможность исследовать неделящиеся клетки, однако его чувствительность зачастую бывает недостаточно для выявления МОБ. Иммунофенотипирование, а именно метод мультипараметрической многоцветовой проточной цитофлюорометрии, базируется на определении аберрантной экспрессии антигенов на клетках лейкемической популяции. Этот метод применим для мониторирования МОБ в 85-90% случаев. Детекция клональных перестроек на генетическом уровне основана на методе ПЦР и используется в настоящее время очень широко.

Таким образом, три метода способны выявлять МОБ у больных ОЛЛ с достаточной степенью чувствительности (103-106):

Одной из целей исследования МОБ является измерение количества остаточной лейкемической популяции, поэтому в настоящее время широкое распространение получила количественная ПЦР в реальном времени.

Самым большим препятствием к использованию любой их этих методик для исследования МОБ является отсутствие универсального метода, одинаково успешно применимого для всех пациентов. Так как ПЦР может выявить остаточную лейкемическую популяцию, не определяемую цитометрией (а иногда – наоборот), по возможности, нужно использовать оба этих метода.

Анализ профилей генной экспрессии

Исследование профиля генной экспрессии стало реальностью, которая, возможно, значительно изменит практику ведения больных с ОЛЛ. Изучение иерархии кластеров экспрессирующихся генов при ОЛЛ взрослых позволило выделить две четко разделяющиеся группы, точно коррелирующих с Т- или В-фенотипом лейкемических клеток. Дальнейший анализ идентифицировал профили генной экспрессии, специфичные для определенных генных перестроек, таких, как MLL-AF4, BCR-ABL, E2A-PBХ1. Более того, интегрированный анализ случаев взрослых и детских ОЛЛ выявил значительное совпадение профилей генной экспрессии между случаями заболевания с одинаковыми хромосомными аберрациями, независимо от возраста пациентов.

Использование этого метода показало, что данные генетические нарушения определяют экспрессию различных генных кластеров. Возможно, в отдельных случаях определенные генетические аберрации могут быть определены с помощью изучения профиля экспрессии, даже в случаях негативных результатов ПЦР. В ближайшее время станет понятным, внесет ли эта инновационная технология свой вклад в классификацию лейкозов.

Заключение

Информация, полученная в результате исследований кариотипа, молекулярной генетики, иммунофенотипирования, а в дальнейшем – профиля генной экспрессии, поможет лучшему пониманию биологии ОЛЛ. Таким образом, будут достигнуты следующие цели:


Участники проекта:

ОНКОЛОГИЯ.ру – профессиональный ресурс для специалистов-онкологов Портал для пациентов, их родственников и близких Cайт для врачей по проблемам онкогематологии-СПИД проф. Пивника А.В. Журнал КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ Журнал ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ Журнал ВОПРОСЫ ГЕМАТОЛОГИИ/ОНКОЛОГИИ И ИММУНОПАТОЛОГИИ В ПЕДИАТРИИ